Ποια είναι η διαφορά μεταξύ ενός συμβατικού συστήματος PCR και ενός συστήματος PCR πραγματικού χρόνου;


Απάντηση 1:

Με λίγα λόγια, η αρχή είναι ίδια: έχετε δύο πριμοδότες (FW και RV). Σχεδιάζονται σε σχέση με έναν συγκεκριμένο στόχο ή έχουν σχεδιαστεί για να συνδέονται με διάφορους στόχους, αλλά έχουν μια συντηρητική ακολουθία από κοινού.

Τώρα, σε PCR σε πραγματικό χρόνο, η χρήση των εκκινητών συνδέεται με μια φθορίζουσα χρωστική ουσία που δεσμεύεται μέσα σε ένα διπλό κλώνο DNA (επίσης γνωστό ως παρεμβαλλόμενο μέσο, ​​όπως το SYBR Green) ή με ανιχνευτές που φέρουν μαζί τους ένα φθοροχρόμετρο και ένα Quencher. Τόσο η προσέγγιση (αν θέλετε να τις ξέρετε λεπτομερώς θα σας εξηγήσω, αλλά εδώ θα τηρήσω την κύρια ερώτηση) επιτρέπουν την παρακολούθηση της ενίσχυσης του στοχευόμενου μορίου DNA κατά τη διάρκεια του βήματος ενίσχυσης, σε πραγματικό χρόνο, παρέχοντας στον ερευνητή μια ποσοτική ανάλυση.

Γιατί είναι χρήσιμο αυτό;

Τι κάνει η PCR; Ενισχύει. Κάθε συμβάν ενίσχυσης αποκαλείται κύκλος ενίσχυσης. Συνήθως οι κύκλοι ενίσχυσης διατηρούνται κάτω από τους 30 κύκλους ανά αντίδραση (μεταξύ 25 και 28). Γιατί αυτό? Επειδή η PCR χρησιμοποιείται για να δει αν κάτι υπάρχει ή όχι, ή αν κάτι υπάρχει σε αυτή την κατάσταση λίγο πολύ σε σύγκριση με ένα controll. Εάν τα βήματα ενίσχυσης είναι πάρα πολύ, δεν θα μπορέσετε να καταλάβετε αν υπάρχει κάτι πραγματικά ή βλέπετε ένα σήμα μόνο επειδή το αφήσατε να ενισχύσει τόσα πολλά χρονικά, έτσι ώστε τελικά να φαίνεται ότι υπάρχει κάτι εκεί δεν λέει "να ποσοτικοποιήσει" επειδή το πρότυπο PCR καθιστά αδύνατη τη φύση του να το κάνει αυτό).

Για παράδειγμα, το Α ήταν μικρότερο από το B. Η ενίσχυση ξεκινάει και μετά από 30 κύκλους τρέχετε ένα πήκτωμα και τα Α και Β έχουν και ένα ισχυρό σήμα. Έτσι λέτε "A = B, δεν υπάρχει διαφορά μεταξύ ελέγχου και πειράματος". Αυτό δεν θα συνέβαινε αν είχατε κάνει μόλις 25 κύκλους, για παράδειγμα, βλέπετε τι εννοώ;

Ενώ στο PCR πραγματικού χρόνου, μπορείτε να δείτε κύκλο ανά κύκλο πόσο amplifcon (το ενισχυμένο σκέλος) ήταν εκείνη τη στιγμή κατά τη διάρκεια αυτού του συγκεκριμένου κύκλου. Έτσι, εάν τρέξετε 30 κύκλους, όταν λάβετε το αποτέλεσμα, κοιτάζοντας τον προηγούμενο κύκλο ενίσχυσης, μπορείτε να πείτε "εντάξει η διαφορά είναι πραγματική" ή "δεν υπάρχει διαφορά".

Αυτό είναι στην πραγματικότητα των έργων λογισμικού. Έχετε κατώφλι (έτσι θα δείτε το σήμα, μόνο αν είναι πάνω από μια ορισμένη ποσότητα, αυτό μπορεί να οριστεί από το scitist, βασισμένο στην δική του εμπειρία της ανάγκης). Και όπως μπορείτε να δείτε, πάνω από εκεί τον κύκλο 30, ο αριθμός αρχίζει στο οροπέδιο. Στο σημείο αυτό δεν θα είναι δυνατόν να γίνει διάκριση μεταξύ των πραγμάτων, διότι θα φανεί το ίδιο! Αλλά, το λογισμικό σας επιτρέπει να κοιτάξετε όλους τους κύκλους και να έχετε μια επισκόπηση του τι συνέβη κύκλος ανά κύκλο.

Ελπίζω ότι βοηθάει, εάν χρειάζεστε περισσότερες λεπτομέρειες ή οποιαδήποτε διευκρίνιση, απλά ενημερώστε με.


Απάντηση 2:

Δεν το ρωτήσατε, αλλά θα επισημάνω ότι υπάρχει ένα άλλο ποσοτικό σύστημα PCR που αυξάνεται σε δημοτικότητα: ψηφιακή PCR.

Το μειονέκτημα της PCR σε πραγματικό χρόνο είναι ότι δεν μπορείτε να λάβετε αληθινά ποσοτικά αποτελέσματα χωρίς να προκαλέσετε αντιδράσεις εναντίον προτύπων. Ένας βασικός λόγος για αυτό είναι ότι διαφορετικά αμπλικόνια θα παρουσιάζουν διαφορετικές αποδόσεις ενίσχυσης, οι οποίες με τη σειρά τους μπορούν να επηρεαστούν από μεταβολή των συνθηκών αντίδρασης (όπως μη-ομοιομορφία ελέγχου θερμοκρασίας διαμέσου της πλάκας PCR) ή μολυντές δείγματος. Η ψηφιακή PCR εξαλείφει αυτά τα προβλήματα μετατρέποντας την PCR σε δυαδικό σύστημα: είτε παρατηρείται είτε δεν παρατηρείται ενίσχυση.

Η ψηφιακή PCR συνίσταται στην εκτέλεση πολλών αντιδράσεων PCR παράλληλα χρησιμοποιώντας το ίδιο υλικό εισόδου. Το τέχνασμα είναι ότι το δείγμα αραιώνεται έτσι ώστε πολλοί θάλαμοι αντίδρασης αναμένεται να δεχθούν μόρια προτύπου. Διεξάγεται η PCR και μετράται ο αριθμός των θετικών θαλάμων. Η σύνδεση αυτή σε εξισώσεις με βάση την κατανομή Poisson δίνει μια εκτίμηση για τον αριθμό των μορίων εισόδου. Επειδή βασίζεται στην καταμέτρηση, ο αριθμός δεν εξαρτάται από μια τυπική καμπύλη. είναι πολύ δύσκολη.

Ένας αριθμός ψηφιακών συστημάτων PCR έχουν διατεθεί στο εμπόριο, χρησιμοποιώντας φρεάτια ή σταγονίδια για τους θαλάμους αντίδρασης. Διαφέρουν επίσης από τον αριθμό των θαλάμων PCR. Τα συστήματα σταγονιδίων χτύπησαν πολύ, πολύ μεγαλύτερους αριθμούς. Η ακρίβεια και η δυναμική εμβέλεια συνδέονται με τους αριθμούς των σταγονιδίων - με περισσότερους θαλάμους μπορείτε να είστε πιο μακριά από την αρχική σας συγκέντρωση.

Τα διαφορετικά συστήματα προσφέρουν διαφορετικό κόστος εξοπλισμού και ευκολία ροής εργασίας. Για παράδειγμα, η συσκευή Fluidigm είναι πλήρως ενσωματωμένη αλλά προσφέρεται ότι πιστεύω ότι υπάρχουν λιγότεροι από 1000 θάλαμοι ανά δείγμα, ενώ το σύστημα της BioRad έχει ξεχωριστά στάδια γαλακτωματοποίησης, πολλαπλασιασμού και μέτρησης (με δύο ειδικούς μηχανισμούς, θερμοκυκλοφορία σε τυπικό θερμοκυκλοφορητή) και δεκάδες χιλιάδες θαλάμους.